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簡(jiǎn)介

獲得高質(zhì)量和完整的 RNA 是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最重要的一步，當(dāng)前應(yīng)用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法,。

原理

1、４℃ 預(yù)冷離心機(jī);

2,、取出培養(yǎng)皿,，在超凈臺(tái)中去除培養(yǎng)基，按照每 1x107 細(xì)胞加入 １ｍL Trizol 試劑,，用槍頭吹打充分裂解細(xì)胞;

3,、將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 無(wú) RNA 酶的 EP 管中，向每個(gè) EP 管中加入（1/5 Trizol 體積的）200 μL 氯仿,，上下翻轉(zhuǎn)充分混合后,，室溫靜置 10 分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物wan全解離;

4,、在 ４℃ 下 12000 g 離心 15 分鐘;

5,、離心后，將上層水相（約 1/2 Trizol體積）小心轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 EP 管,，加入等體積異丙醇,，震蕩后室溫靜置 5-10 分鐘，然后 12000 g 4℃ 離心 15 分鐘，棄上清保留沉淀;

6,、加入1 mL 75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA,，12000 g 離心 10 分鐘;

7、棄上清,，并重復(fù)上述操作一次;

8,、棄上清，在超凈工作臺(tái)中打開 EP 管蓋,，風(fēng)干 5-10 分鐘,，不需wan全干燥;

9、視沉淀的量,，加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 雙蒸水中;

10,、待沉淀溶解后，用 nanodrop 測(cè)定其濃度和純度并作標(biāo)記,，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn),，多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

用途

RT-PCR,、分子克隆,、Northern-Blot、RNA 體外轉(zhuǎn)錄與翻譯等,。

材料與儀器

【材料】：細(xì)胞,；Trizol 試劑；氯仿,；異丙醇,；75％ 乙醇（使用 RNase-Free 水配制）；RNase-Free 水,。

【物品及儀器】：1.5 ml EP管（RNA-free）,，大，中,，小號(hào)槍頭（RNA-free）,，移液器，渦旋振蕩器,，高速冷凍離心機(jī),，超凈工作臺(tái)。

步驟

1,、４℃ 預(yù)冷離心機(jī);

2,、取出培養(yǎng)皿，在超凈臺(tái)中去除培養(yǎng)基,，按照每 1x107 細(xì)胞加入 １ｍL Trizol 試劑,，用槍頭吹打充分裂解細(xì)胞;

3、將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 無(wú) RNA 酶的 EP 管中，向每個(gè) EP 管中加入（1/5 Trizol 體積的）200 μL 氯仿,，上下翻轉(zhuǎn)充分混合后,，室溫靜置 10 分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物wan全解離;

4,、在 ４℃ 下 12000 g 離心 15 分鐘;

5,、離心后，將上層水相（約 1/2 Trizol體積）小心轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 EP 管,，加入等體積異丙醇,，震蕩后室溫靜置 5-10 分鐘，然后 12000 g 4℃ 離心 15 分鐘,，棄上清保留沉淀;

6,、加入1 mL 75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA，12000 g 離心 10 分鐘;

7,、棄上清,，并重復(fù)上述操作一次;

8、棄上清,，在超凈工作臺(tái)中打開 EP 管蓋,，風(fēng)干 5-10 分鐘，不需wan全干燥;

9,、視沉淀的量,，加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 雙蒸水中;

10、待沉淀溶解后,，用 nanodrop 測(cè)定其濃度和純度并作標(biāo)記,，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱,。

注意事項(xiàng)

1,、過程中需佩戴口罩和新手套，對(duì)臺(tái)面以及周圍環(huán)境進(jìn)行滅酶處理,，盡量在超凈臺(tái)中進(jìn)行操作；

2,、使用無(wú) Rnase 的塑料制品和槍頭,，避免交叉污染。

3,、溶液配制應(yīng)使用無(wú) Rnase 的水,，（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入 DEPC 至終濃度為 0.1%（V/V),，放置過夜,，高壓滅菌。注：DEPC 有致癌之嫌，須小心操作）,。

4,、Trizol 裂解液非常危險(xiǎn)，因小心避免濺到身上,，臺(tái)面上的 Trizol 要及時(shí)清理干凈,。

常見問題

RNA 得率過低：

1.使用更有效的破碎/勻漿方法。如液氮搗碎,、酶消化破壁,、電動(dòng)勻漿器勻漿；

2.更換抽提試劑,；

3.核酸濃度低時(shí),，采用低溫沉淀，并延長(zhǎng)沉淀時(shí)間,；

4.增加細(xì)胞,。

RNA 質(zhì)量不高：

1、取上層水相時(shí)求多,，吸到了下層有機(jī)相,；

2、清洗不干凈,。

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