腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)
重組腺病毒載體是基于人腺病毒 5 型（Ad5）,，其基因組是 36kb 長(zhǎng)的線性雙鏈 DNA，是一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng),。具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：感染范圍廣,，幾乎可以感染所有的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織；感染效率可高達(dá) 100%,；對(duì)外源基因容載能力大（可以高達(dá) 8Kb）；不整合基因組,；滴度高,，操作方便。因此,，重組腺病毒是一種最ju有潛力的基因遞送工具,。
最chang用的腺病毒包裝體系有 AdEasy 和 AdMAX 兩種，其共同特點(diǎn)是目的基因首先克隆到穿梭載體,，再重組到腺病毒的大骨架上,。以上兩個(gè)系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3）,，其中 E3 基因?qū)Σ《镜漠a(chǎn)生并非必需,。因此，腺病毒包裝必需依賴表達(dá) E1 的細(xì)胞系,，例如 HEK-293,，HEK-293A 等。
一,、實(shí)驗(yàn)流程
圖 1,、 腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)流程圖
二、實(shí)驗(yàn)儀器與材料
表 1,、腺病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒
三,、實(shí)驗(yàn)步驟
AdMAX 系統(tǒng)：構(gòu)建連接目的基因的 pHBAdMAX質(zhì)粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 質(zhì)粒并大量抽提，用于轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞,。
AdEasy 系統(tǒng)：構(gòu)建連接目的基因的 pHBAdEasy 質(zhì)粒并進(jìn)行酶切線性化,；線性化后轉(zhuǎn)入 BJ5183 感受態(tài)（含 pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒）進(jìn)行重組，涂板培養(yǎng)單克隆并擴(kuò)增,，抽提質(zhì)粒進(jìn)行 PacI 酶切驗(yàn)證,；驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Stbl3 感受態(tài)，得到高純度的重組質(zhì)粒并進(jìn)行 PacI 酶切線性化,，用于轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞,。
表 2、腺病毒包裝轉(zhuǎn)染體系
挑取 3-6 個(gè)空斑不等,，放入1 ml新鮮培養(yǎng)基中過夜,，然后比較滴度，使用滴度最高的一個(gè)空斑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),。（注：病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成,。為了限制病毒的擴(kuò)散而讓空斑更好地形成，可在培養(yǎng)液中加入低熔點(diǎn)瓊脂糖，一般在轉(zhuǎn)染后第 10 ~ 21 天可以在顯微鏡下看到小的空斑,。）
將培養(yǎng)基中的病毒加入新鮮 293A 細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行病毒少量擴(kuò)增,，至再次出現(xiàn)空斑，收集細(xì)胞及上清,，反復(fù)凍融三次收集病毒（P1 代）,，感染 293A 細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行三代感染,，至 P4 代進(jìn)行腺病毒的大量擴(kuò)增并收集病毒,。
將病毒從 -80 ℃ 冰箱取出，室溫水浴融化,。在 4 ℃ 下,，7000 g 離心 10 min，棄細(xì)胞碎片,，收集上清,，0.22 μm 過濾除菌即可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。若用于對(duì)腺病毒滴度和純度要求高的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),，則需要采用 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度離心-透析聯(lián)用法進(jìn)行純化,。
棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀,，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存,，如需長(zhǎng)時(shí)間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。
四,、注意事項(xiàng)
1. 腺病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)請(qǐng)?jiān)谏锇踩瘢?/span>BL-2 級(jí)別）內(nèi)操作,。
2. 操作病毒時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴口罩和手套,，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚,。
3. 操作病毒時(shí)特別小心病毒濺出。如果操作時(shí)超凈工作臺(tái)有bing毒污染,，請(qǐng)立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈,。接觸過病毒的槍頭、離心管,、培養(yǎng)板,、培養(yǎng)液請(qǐng)用84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。
4. 如需要離心,，應(yīng)使用密封性好的離心管,，如有必要請(qǐng)用封口膜封口后離心。
5. 動(dòng)物注射操作請(qǐng)?jiān)谏锇踩駜?nèi)（BL-2 級(jí)別）完成,。
6. 病毒相關(guān)的廢棄物需要特殊收集,，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理,。
7. 實(shí)驗(yàn)完畢用洗手液清洗雙手。
五,、常見問題
第一代腺病毒載體：E1/E3 基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體,；
第二代腺病毒載體：E2A/E4 基因缺失的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體,，產(chǎn)生的免疫原性較低，載體容量和安全性方面均提高,，但病毒包裝難度和出毒滴度嚴(yán)重下降，應(yīng)用受限,。
第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的或大部分腺病毒基因,，僅保留了兩端 ITR 和包裝信號(hào)。包裝容量高達(dá) 35kb,，免疫原性極低,，載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因用于外源基因長(zhǎng)期表達(dá)并增加了載體的穩(wěn)定性。但第三代載體系統(tǒng)需要腺病毒突變體作為輔助病毒,。
目前,，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應(yīng)用最為廣泛的腺病毒載體，因此更為推薦,。
需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)以及需求進(jìn)行選擇。
（1）AdEasy 系統(tǒng)：操作步驟相對(duì)可控,，AdEasy 系統(tǒng)得到的病毒滴度相對(duì)較高,。AdEasy 系統(tǒng)是較常用的系統(tǒng)，在 BJ5183 感受態(tài)中完成環(huán)狀腺病毒基因組的重組,，將重組腺病毒基因組經(jīng) Pac I 酶切線性化后轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞,。但重組腺病毒基因組的陽性率比較低，需要挑選大量的克隆進(jìn)行驗(yàn)證,。
（2）AdMax 系統(tǒng)：是直接將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒導(dǎo)入到包裝細(xì)胞 293A 中,，重組過程不可控，中間無法進(jìn)行篩選,，所以重組假陽性較高,，篩選陽性結(jié)果的難度較 AdEasy 系統(tǒng)高很多。 但 AdMax 包裝系統(tǒng)流程更簡(jiǎn)便易操作,，適合新手研究人員,。
純化后的腺病毒可以去除缺損的病毒顆粒,、細(xì)胞毒素,、細(xì)胞培養(yǎng)基,、以及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。純化腺病毒免疫原性較低,，更適合做動(dòng)物實(shí)驗(yàn),。
4. 腺病毒感染毒斑和細(xì)胞聚集怎么進(jìn)行區(qū)分？
鏡下觀察發(fā)現(xiàn)類似病毒空斑或者細(xì)胞聚集的現(xiàn)象時(shí),，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 1-3 天,，觀察聚集區(qū)域是否擴(kuò)散，若持續(xù)擴(kuò)散一般為病毒毒斑,，若聚集區(qū)域保持不變，則一般為細(xì)胞聚集現(xiàn)象,。
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