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【科捷儀器】

  由于高效液相色譜系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)界的用戶(hù)越來(lái)越多,，了解高效液相色譜技術(shù)和儀器裝置及工作原理很有必要,。南京科捷在本文中簡(jiǎn)述高效液相色譜技術(shù)的系統(tǒng)組成、工作原理,、臨床應(yīng)用及常見(jiàn)故障處理,。

1   高效液相色譜法（High Perfor mance Liquid Chrom atograph Y HPLC）

    隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，要求分離出入體中某種特定化合物,，并給予定性分析和定量測(cè)定,。色譜技術(shù)是一種常用的分離技術(shù)，它的分離原理是基于混合物中各組分在經(jīng)過(guò)一個(gè)由固定相和流動(dòng)相組成的體系時(shí),，由于各組分在化學(xué)性質(zhì)上的差異,，在兩相中具有不同的分配系數(shù)，兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),，被分析的混合組分隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng),，并在兩相中進(jìn)行多次的吸附和分配，使得那些分配系數(shù)只有很小差別的組分,。在移動(dòng)速度上產(chǎn)生很大差別,，從而使各組分得到分離。通俗地說(shuō)流動(dòng)相就是帶動(dòng)樣品在色譜柱里流動(dòng)的物質(zhì),，它相當(dāng)于溶劑,，固定相就是填充在柱子里的物質(zhì),，它相當(dāng)于吸附劑。每種固定相都具有不同的性質(zhì),。

    流動(dòng)相是氣體的叫氣相色譜,。流動(dòng)相是液體的就叫液相色譜。氣相色譜法具有快速,，分離效率高,。用樣量少等特點(diǎn)，但要求樣品能夠汽化,。從而受到樣品的揮發(fā)性限制,。

    高效液相色譜法（HPLC）是由現(xiàn)代高壓技術(shù)與傳統(tǒng)的液相色譜方法相結(jié)合，加上高效柱填充物和高靈敏檢測(cè)器所發(fā)展起來(lái)的新型分離分析技術(shù),。由于它只要求樣品能制成溶液,，而不需要汽化，因此不受樣品揮發(fā)性的約束,。對(duì)于揮發(fā)性低,，熱穩(wěn)定性差，分子量大的高分子化合物以及離子型化合物尤為有利,。如氨基酸,、蛋白質(zhì)、生物堿,、核酸,、甾體、脂類(lèi),、維生素,、抗生素等分子量較大。沸點(diǎn)較高的合成藥物以及無(wú)機(jī)鹽類(lèi),。所以說(shuō)HPLC具有適用范圍廣,、分離效率高、速度快,、流動(dòng)相可選擇范圍寬,、靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用,、流出組分容易收集等優(yōu)點(diǎn),。

    不同種類(lèi)的柱可以進(jìn)行不同類(lèi)型的液相色譜分離，也產(chǎn)生了不同的液相色譜法,。如正向色譜,、反向色譜、離子對(duì)色譜、離子交換色譜,、凝膠色譜等。

2  高效液相色譜系統(tǒng)及工作原理

    高效液相色譜系統(tǒng)流程如圖1所示

圖1高效液相色譜系統(tǒng)流程圖

    由流程圖可看出系統(tǒng)是由儲(chǔ)液器,，泵,，進(jìn)樣器，分離柱,，檢測(cè)器,，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入進(jìn)樣系統(tǒng)或進(jìn)樣器,。樣品通過(guò)進(jìn)樣器以精確的體積插入流動(dòng)相中,。再被流動(dòng)相帶到柱內(nèi)，分離過(guò)程在柱內(nèi)進(jìn)行,，被分離成單個(gè)組分的樣品依次從柱內(nèi)流出,，通過(guò)檢測(cè)器樣品濃度被轉(zhuǎn)變成電信號(hào)送到記錄器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)，經(jīng)系統(tǒng)處理,。數(shù)據(jù)以圖譜和圖表形式打印出來(lái),。

3  高效液相色譜儀在醫(yī)院臨床中的應(yīng)用

    HPLC技術(shù)主要應(yīng)用是在臨床藥學(xué)和臨床學(xué)中。臨床藥學(xué)主要是治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）和藥代動(dòng)力學(xué),。HPLC之所以在TDM中占有重要地位,。其主要原因是：

    （1）可以同時(shí)監(jiān)測(cè)不同種類(lèi)的藥物。

    （2）一次進(jìn)樣可同時(shí)分析原藥及代謝產(chǎn)物,。

    （3）分離和定量同時(shí)進(jìn)行．具有較高的準(zhǔn)確性和精確度,。此外HPLC還具有*的經(jīng)濟(jì)效益比，花費(fèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它傳統(tǒng)方法,。目前用HPLC分析臨床常用藥物超過(guò)數(shù)百種,。已廣泛用于TDM中的如抗癲癇藥，抗心律失常藥,。茶堿．撲熱息痛,，環(huán)孢霉索等。在臨床研究方面,，許多復(fù)雜化合物或內(nèi)源代謝物也可用HPLC法分析,。如血中兒茶酚胺、氨基酸,、激素,、前列腺素、多肽,、核酸等,。
此外HPLC還可應(yīng)用到臨床診斷中，如在新生兒疾病篩查中，開(kāi)發(fā)了血紅蛋白病的Hb,，苯丙酮尿酸癥的PKU,，成神經(jīng)細(xì)胞瘤等方法。

    需要注意的是臨床樣品都是生物樣品,，如血,、尿、痰,、體液等,，成分復(fù)雜，性質(zhì)各異,，生物大分子多,，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚コ承└蓴_物,。處理時(shí)嚴(yán)格按要求去做,，否則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或造成柱的阻塞，甚至報(bào)廢,。

4  高效液相色譜儀常見(jiàn)故障處理

    故障l  系統(tǒng)壓力不穩(wěn),，噪音增加，色譜圖上出現(xiàn)毛刺,。

    原因  管道中吸入空氣,，溶人流動(dòng)相中的空氣．泵墊圈磨損引起的泄漏，微粒污染單向閥均可引起上述癥狀,。

    處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量,，保證不銹鋼濾器（沉子）沉人儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣,。流動(dòng)相要充分脫氣,。泵墊圈是系統(tǒng)中zui易磨損的部件，泵墊圈的磨損易造成高壓下的壓力不穩(wěn),，并會(huì)由泵頭滲出流動(dòng)相,，一旦發(fā)現(xiàn)立即換上新墊圈，有條件的應(yīng)定期更換泵墊圈,。上述問(wèn)題解決后泵仍不能正常工作,，考慮單向閥的微粒污染問(wèn)題。小心地拆下單向閥,，放入10％的硝酸溶液中超聲清洗15分鐘．再反復(fù)用色譜級(jí)水清洗數(shù)遍,，zui后用甲醇清洗兩次，用洗耳球由進(jìn)液方向反吸氣,，如不通氣說(shuō)明故障已排除,，裝上單向閥即可。

    故障2  柱壓高。

    原因  一是樣品沉積在柱內(nèi),，二是柱內(nèi)濾片阻塞,。

    處理  對(duì)*種情況，可用能溶解所測(cè)樣品的溶劑沖洗,，沖洗時(shí)拆開(kāi)柱與檢測(cè)器之間的接頭,，正向沖洗，或?qū)⒅隹诮釉诒蒙戏聪驔_洗,。注意不要讓沖洗液通過(guò)檢測(cè)器流動(dòng)池，避免流動(dòng)池污染,。沖洗30分鐘后接上檢測(cè)器,。若沖洗不見(jiàn)效，考慮第二種情況,，更換柱頭濾片,。

    故障3  出峰不佳，峰分叉（雙峰）,。

    原因  柱頭填料塌陷,。

    處理  擰開(kāi)柱頭,，取出濾片,，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料）,，裝入新填料,，滴一滴甲醇，填料下陷．再填,，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平面光滑的不銹鋼桿壓緊,，再填平，滴甲醇,。再壓緊反復(fù)幾次,，直至裝滿(mǎn)填平。擦干凈柱外壁的填料,，加上新濾片,，擰緊柱頭，接上泵沖洗,，用流動(dòng)相沖洗30分鐘后再接檢測(cè)器,。

    故障4  換柱后出現(xiàn)峰肩。

    原因  柱安裝位置不佳,。

    處理  松開(kāi)柱,，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一角度，重新安裝上緊，*甲醇沖洗30分鐘即可,。

    故障5  峰面積改變,。

    原因  加樣針不到位。

    處理檢查加樣針是否插到底．保證針到位,。實(shí)際工作中碰到的問(wèn)題很多,，日常保養(yǎng)很重要。如儲(chǔ)液器的清潔,，流動(dòng)相的脫氣,，每天用后系統(tǒng)中的緩沖液要沖洗干凈。先用蒸餾水沖洗15分鐘,，然后用甲醇沖洗,，防止無(wú)機(jī)鹽沉積造成系統(tǒng)內(nèi)的磨損和阻塞，這些都可以減少故障的發(fā)生,。另外對(duì)HPLC技術(shù)及設(shè)備原理的了解也非常重要,，這樣就能夠提高儀器的利用率，更好地發(fā)揮儀器作用,。