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產(chǎn)品名稱：

商品名稱：綿羊痘病毒PCR試劑盒

Name：Sheeppox Virus(SPPV) PCR試劑盒

包裝規(guī)格：50T/盒

預(yù)期用途

綿羊痘是由羊痘病毒屬中綿羊痘病毒（Sheep pox virus, SPV）引起羊的一種急性、熱性,、接觸性傳染病,，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為需通報(bào)傳染病，我國列為一類動(dòng)物疾病,。該病主要表現(xiàn)為體溫升高,，皮膚、黏膜,、內(nèi)臟器官表面發(fā)生廣泛性的丘疹,、皰疹或結(jié)節(jié)，淋巴結(jié)腫大,，病畜消瘦，毛的品質(zhì)下降,，產(chǎn)乳量大幅度降低,，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。羊痘分布廣泛,，世界各國具有本病爆發(fā)和流行的相關(guān)報(bào)道,，中東,、非洲北部及中部、亞洲流行尤為嚴(yán)重,。

本試劑盒適用于檢測綿羊皮膚病變組織,、淋巴結(jié)、水泡液等樣本中的綿羊痘病毒,，用于綿羊痘病毒感染的輔助診斷,。

檢驗(yàn)原理：

綿羊痘病毒PCR試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)綿羊痘病毒特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針,， 用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)綿羊痘病毒的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷,。

試劑組成：

說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用,。

儲(chǔ)存條件及有效期：

-20℃±5℃，避光保存,、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個(gè)月,。

適用儀器：

ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

標(biāo)本采集：

綿羊皮膚病變組織,、淋巴結(jié) 5g,；水泡液取 1mL。

保存和運(yùn)輸：

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h,；若需長期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次,。

使用方法：

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,，手/術(shù)/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于1.5mL 滅菌離心管中,；咽/拭子樣品直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,。

1.2  核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸/提取/或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請(qǐng)按照試劑說明書進(jìn)行操作,。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照,；樣品每滿

10 份，多配制 1 份),，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光,，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.   結(jié)果分析判定

5.1   結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15,、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2   結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3   質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效,。

6.檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

3. 陽性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

4. 病原體在流行過程中基因突變,、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，wan全混勻并短暫離心,；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6. 樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染,；

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理,。

【參考文獻(xiàn)】

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