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產(chǎn)品名稱：諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

Name：Norwalk Virus G1(NV-1) RT-PCR Kit

包裝規(guī)格：50T/盒,。

諾如病毒（Norwalk Virus）是單股正鏈 RNA 病毒,，屬于人類杯狀病毒屬，是一種引起非細(xì)菌性急性腸胃炎的病毒,，如諾病毒感染性強(qiáng),，以腸道傳播為主， 通過口-糞傳播,，以污染的水源,、食物、貝類,、物品,、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個基因群,，其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群,。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測諾如病毒 G1 型的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高,，引物是根據(jù)諾如病毒 G1 型高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會跟其他病毒的RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng),。

6.本產(chǎn)品只能用于科研,。

規(guī)格及成分

諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為12個月,。

自備試劑樣品：RNA

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭,，下同）,。

3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4.換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個樣品,，最好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽

性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?0μL 陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為PC,。另外用水作為 NC,。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。

三,、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35,，則為陽性,。