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檸檬酸合酶（citrate synthase,，CS）試劑盒說明書

                                        微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                          

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶,，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

測(cè)定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶/A,，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸,；該反應(yīng)促使無(wú)色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰,、無(wú)水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑二：液體20mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1支,，-20℃保存,；

試劑四：液體28mL×1瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶,，4℃保存,；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存,，臨用前加入1.2mL蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

②        將勻漿600g,，4℃離心5min。

③        棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min,。

④        上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）,。

⑤        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W,，超聲3秒,，間隔10秒，重復(fù)30次）,，用于線粒體CS測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入0.6mL無(wú)水乙醇和13mL試劑四,，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

（2）測(cè)定管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑五和10μL試劑六,，混勻,，37℃反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A1。

（3）對(duì)照管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑四和10μL試劑六,，混勻，37℃

反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A2,。

（4）計(jì)算ΔA=A1-A2,，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CS活性計(jì)算：

a.        使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn),。

b.       使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=47.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.095×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn),。

檸檬酸合酶（citrate synthase,，CS）試劑盒僅供科研！