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使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本 產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 6，5,，4,，3，2,，1,。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭,， 下同,。 

3. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。 

4. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。 

5. 換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。 

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品待提取,，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的是 PC（樣品制備陽(yáng) 性對(duì)照）和 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢匀￡?yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致,，以此作 為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容,。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后最后加）

11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：