偽狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

通用名稱：偽狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Pseudorabies Virus gH gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型,、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒,、奧葉茲基氏病病毒,。是引起牛、羊,、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱,、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1],。豬是偽狂犬病的唯-一自然宿主，對其危害大,。可致妊娠母豬流產(chǎn),，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化,。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào),，麻痹，衰竭死亡,，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染,，但可引起呼吸道癥狀[2],。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源,，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液,、乳汁和尿中排除,，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理,，檢測偽狂犬病毒，對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評

估有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),，設(shè)計(jì)一對偽狂犬病病毒通用型特異性引物，結(jié)合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術(shù)對偽狂犬病病毒通用型的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI ,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺的豬,，取腦,、淋巴結(jié)、脾臟,、肺臟等組織,；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物,、唾液、乳汁等,，   置于 50%甘油生理鹽水中,，或用注射器取血 5mL。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月,，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0. 5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；分泌物棉拭子直接取 100μL 提??；血液取血清 100μL 提取。

1.2 核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,，請按照    試劑說明書進(jìn)行操作,。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份),，單個(gè)測試反應(yīng)液體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，21μL/管,。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光,，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果,。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38,，建議重復(fù)檢測,，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線,， 判定為陽性,，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值,。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32,；以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

7. 檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心,；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；

5. 使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6. 樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染,；

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 婁高明,，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場防制策略[J]．中國動物檢疫,，1999，16（5）：43－45.

[2] 殷震,，劉景華．動物病毒學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，1997.

[3] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 35911-2018 偽狂犬病病毒熒光 PCR 檢測方法.[S].