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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：黃熱病毒（YFV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Diagnostic Kit for Yellow Fever Virus RNA(Real-Time RT-PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】 本試劑盒適用于檢測的疑似感染病人的靜脈血等標(biāo)本中黃熱病毒 RNA,，適用于黃熱病毒感染的輔助診斷,。 其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗(yàn)原理】 本試劑盒用一對黃熱病毒特異性引物,，結(jié)合一條特異性熒光探針,，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對黃熱病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲(chǔ)存條件及有效期】 -20℃±5℃,，避光保存、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】 ABI ,、安捷倫 MX3000P/3005P,、MJ Opticon2、LightCycler480,、Bio-Rad,、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】 疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管,。

【保存和運(yùn)輸】 上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月,，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn) 輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理 按 RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取

1.2 核酸提取 推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提 取,，請按照試劑說明書進(jìn)行操作,。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)） 根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應(yīng)管 數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),； 設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul,；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請勿選擇 ROX 參比熒光,。

4.2 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析 后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果,。

5.2 結(jié)果判斷 陽性：檢測通道 Ct 值≤35,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38,，建議重復(fù)檢測,，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線,， 判定為陽性,，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值,。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示,； 陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)； 2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,； 3.陽性對照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果； 4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果； 5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,； 6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果,； 7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】 1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,； 2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，*混勻并短暫離心； 3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,； 4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊； 5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,； 6.樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染； 7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,； 8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。