【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬多殺性巴氏桿菌（SPA）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name：Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
多殺性巴氏桿菌是一種常見病原菌,，可感染豬、牛,、家禽等多種動物，引起豬肺疫,、牛出血性敗血癥,、禽霍 亂等多種臨床疾病[1]。
本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子,、肺組織等樣本中的豬多殺性巴氏桿菌,，用于豬多殺性巴氏桿菌感染的 輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù),，設(shè)計一對豬多殺性巴氏桿菌特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針[2]，用熒光 PCR 技術(shù)對豬多殺性巴氏桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測,，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學檢測,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
SPA 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
SPA 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存,、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月,。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標本采集】
病死或撲殺豬,，無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物,， 放入無菌試管中
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,， 嚴禁反復凍融,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,，請按照 試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：
試劑SPA 反應液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，21μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻，短暫離心,。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,，反應體系設(shè)置為 25μL,；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光,，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及 Threshold 的Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38,，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,，且曲線有明顯的增長曲線,， 判定為陽性，否則為陰性,；
陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值,。
6.質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無 Ct 值；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,，且Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效,。
7.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果,；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結(jié)果；
6.試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。
【參考文獻】
[1]曾靜雯, 劉慧芳, 沈琴芳, 等. 多殺性巴氏桿菌鑒定與特性研究的分子生物學方法[J]. 中國獸藥雜志, 2006.
[2]李鵬, 馬艷嬌, 夏偉, 等. 豬肺炎支原體,、多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌三重 PCR 檢測方法的建立. 中國預防獸醫(yī)學報, 2010.
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