豬圓環(huán)病毒 3 型（PCV-3）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬圓環(huán)病毒 3 型（PCV-3）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Porcine Circovirus type Ⅲ Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
豬圓環(huán)病毒（Porcine circoviruses,，PCV）是單股環(huán)狀的 DNA 病毒，基因組長度約為 1.7kb 長,，是最小的動物 DNA 病毒之一,。已經(jīng)確定有兩種類型的 PCV，即圓環(huán)病毒 1 型（PCV1）和圓環(huán)病毒 2 型（PCV2）,。2015-2016年間,，一種新型的圓環(huán)病毒 3 型病毒首先在美國報道，該病毒基因組長為 2.0kb,，其能引起豬的皮炎腎病終合癥,、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，對豬場疾病控制十分重要,。
本試劑盒適用于檢測肺,、淋巴結(jié)組織、全血等樣本中的豬圓環(huán)病毒 3 型,，用于豬圓環(huán)病毒 3 型感染的輔助診
斷,。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù),，設(shè)計一對豬圓環(huán)病毒 3 型特異性引物，結(jié)合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術(shù)對豬圓環(huán)病毒 3 型的核酸進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學(xué)檢測,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
PCV-3 反應(yīng)液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
PCV-3 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存,、運輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月,。
【適用儀器】
ABI ,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的豬,，取肺,、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬,，用注射器取血 5mL,。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月,，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復(fù)凍融,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL滅菌離心管中,；全血樣本：待血凝固后,，取血清 100μL 于滅菌離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,，請按照 試劑說明書進行操作,。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份）,，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑PCV-3 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）,、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）,，以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0,，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗,，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性,。
陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線,。
6.質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效,。
7.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果,；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理,。
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