【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：豬圓環(huán)病毒通用型 （PCV-U）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：Porcine Circovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
豬圓環(huán)病是由豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus）引起豬的一種傳染性,、先天性顫抖和斷奶仔豬多系統(tǒng)功能障礙性疾病。該病毒具有 PCV1 和 PCV2 兩種血清型,，PCV1 無致病性。受 PCV2 感染的斷奶仔豬出現(xiàn)呼吸急促,、困難,、腹瀉、貧血,、明顯的淋巴組織病變及進(jìn)行性消瘦,。
本試劑盒適用于檢測(cè)肺、淋巴結(jié)組織,、全血等樣本中的豬圓環(huán)病毒通用型,，用于豬圓環(huán)病毒通用型感染的輔 助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒對(duì)豬圓環(huán)病毒基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)豬圓環(huán)病毒通用型的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于科研上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)檢測(cè)。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
PCV-U 反應(yīng)液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
PCV-U 陽性質(zhì)控品 1.49×10^8拷貝/mL50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃避光保存,，有效期 12 個(gè)月,。避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次,；生產(chǎn)日期和失效日期見標(biāo)簽,。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。
【標(biāo)本采集】
組織樣品采集：采取病死豬（包括流產(chǎn)的死胎）)或撲殺豬主要臟器（淋巴結(jié),、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟） 裝入滅菌 15 mL 離心管中,，編號(hào),，送實(shí)驗(yàn)室。血清樣品采集：用無菌注射器抽取受檢豬靜脈血不少于 5 ml,，置于無菌離心管內(nèi),，室溫或者 37℃傾斜放置自然凝集 20 min ~30 min，2 000 r/min~3 000 r/min 離心 10 min,，吸取上清液到新的離心管內(nèi)備用,。精液樣品采集：按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。糞便樣品采集：取豬新鮮糞便 1 g,，裝入 15 mI 滅菌離心管中,，加入 5 mL PBS，混勻,。細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融 3 次,，第 3 次解凍后，將細(xì)胞培養(yǎng)物置于 1.5 mL 無 DNA 酶的滅菌離心管內(nèi),，編號(hào)備用,。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：取 1 g 解凍的組織,，剪碎,，加入 2 mL PBS 進(jìn)行研磨，制備組織勻漿,，8000 r/min 離心 5 min,，取上清用于后續(xù)的核酸提取。血清和精液樣品無需進(jìn)行前處理,，直接用于核酸提取,。糞便樣品：3000 r/min 離心 10 min，取上清液,，轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中,，用于后續(xù)的核酸提取。細(xì)胞培養(yǎng)物：4000 r/min,，4℃離心 l0 min,，取上清用于后續(xù)的核酸提取。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進(jìn)行核酸提取,，請(qǐng)按照試劑說明 書進(jìn)行操作,。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份）,，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑PCV-U 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL 管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇：檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX
參比熒光，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15,、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)器，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效,。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；
3.陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
6.試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；
6.樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 35901-2018 豬圓環(huán)病毒 2 型熒光 PCR 檢測(cè)方法[S].
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