【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒,、奇癢癥病毒,、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛,、羊,、豬、犬和貓等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)熱,、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒,。豬是偽狂犬病的唯-一自然宿主,，對(duì)其危害大?？芍氯焉锬肛i流產(chǎn),，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對(duì)初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀,，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào),，麻痹，衰竭死亡,，病死率 100%,。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀,。病豬,、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物,、唾液,、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年,。
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理,，檢測(cè)偽狂犬病毒，對(duì)偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)義,。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)偽狂犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針,。在反應(yīng)體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放 熒光信號(hào),。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析,。
【試劑組成】
名稱規(guī)格
核酸提取液1.5mL×2 管
酶液50μL×1 管
PRV-gB 反應(yīng)液1.0mL×1 管
PRV-gB 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
注：
1）不同批號(hào)試劑不能混用,。
2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)丌超過(guò) 5 次,，有效期 12 個(gè)月,。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺的豬,，取腦,、淋巴結(jié)、脾臟,、肺臟等組織,；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物,、唾液,、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中,，或用注射器取血 5mL。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長(zhǎng)期保存可置-70℃,，但丌能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)丌同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取
0. 5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取,；血液取血清 100μL 提取,。
1.2DNA 提取
1)對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min,，13,000
rpm 離心 5min,，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存,；
2)DNA 的提取也可以采用公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒
（離心柱提取法）,，請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；樣本總數(shù)每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應(yīng)液),，單個(gè)測(cè)試反應(yīng)液體系配制如下表：
試劑PRV-gB 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 DNA,、陽(yáng)性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),，重新分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴(kuò)增曲線,。
可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0,，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線則為陽(yáng)性,，否則為陰性,。
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值丏無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。
6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性對(duì)照：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示,；
陽(yáng)性對(duì)照：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,，丏 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效,。
7.檢測(cè)方法的局限性
7.1樣本檢測(cè)結(jié)果不樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
7.2樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,；
7.3陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
7.4病原體在流行過(guò)程中基因突變,、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
7.5丌同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
7.6試劑運(yùn)輸，保存丌當(dāng)或試劑配制丌準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)丌準(zhǔn)確的結(jié)果,；
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服,；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1]婁高明,，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場(chǎng)防制策略[Ｊ]．中國(guó)動(dòng)物檢疫,，1999， 16（5）：43－45.
[2]殷震,，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)[Ｍ]．北京：科學(xué)出版社,，1997.
[3]朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測(cè)偽狂犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012,，32（10）:1413-1417.
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