【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒 H1N1 亞型(IAV-H1N1)核酸檢測試劑盒（雙重熒光 PCR 法）
Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
流行性感冒（流感）是一種傳染性強的病毒性疾病,，也是人類呼吸道疾病的重要病因,。2009 年發(fā)生的新型甲型 H1N1 流感大流行，波及了全球 66 個國家,，這種流感病毒是由人流感,、禽-流感和豬流感的病毒基因組重組形成的。2010 年 8 月,，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,，WHO） 宣布 2009 年甲型 H1N1 流感大流行結束,。然而,，2009 新型甲型 H1N1 流感病毒已成為季節(jié)性流感在世界范圍內(nèi)持續(xù)傳播，并造成不同程度的暴發(fā)流行,。
本試劑盒適用于檢測標本中的甲型流感病毒 H1N1,，適用于甲型流感病毒 H1N1 感染的輔助診斷及流行病學調查。
【檢驗原理】
本試劑盒分別對甲型流感病毒H1N1 亞型的HA 和NA 基因設計特異性的引物和探針,，用一步法熒光 RT-PCR技術對甲型流感病毒 H1N1 RNA 進行體外擴增檢測,，用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
IAV -H1N1 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
IAV -H1N1 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存,、運輸,、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月,。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽,，取喉氣管,、腦、胸肌,、心肌和肺等組織,；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,， 置于 1mL 50%甘油生理鹽水中,。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存,，應放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 提取,。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：
試劑IAV -H1N1 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質控品,、陰性質控品各取 5μL,，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
4.2設置好通道,、樣品信息，反應體系設置為 25μL,；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調整,，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示,；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理,、運送以及保存質量有關,；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果,；
3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果,；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導致假陰性結果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考,，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；
6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。
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