【產(chǎn)品名稱(chēng)】
商品名稱(chēng)：甲型流感病毒 H1N1 亞型(IAV-H1N1)核酸檢測(cè)試劑盒（雙重?zé)晒?PCR 法）
Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預(yù)期用途】
流行性感冒（流感）是一種傳染性強(qiáng)的病毒性疾病,，也是人類(lèi)呼吸道疾病的重要病因。2009 年發(fā)生的新型甲型 H1N1 流感大流行，波及了全球 66 個(gè)國(guó)家,，這種流感病毒是由人流感,、禽-流感和豬流感的病毒基因組重組形成的。2010 年 8 月,，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,，WHO） 宣布 2009 年甲型 H1N1 流感大流行結(jié)束。然而,，2009 新型甲型 H1N1 流感病毒已成為季節(jié)性流感在世界范圍內(nèi)持續(xù)傳播,，并造成不同程度的暴發(fā)流行。
本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的甲型流感病毒 H1N1,，適用于甲型流感病毒 H1N1 感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查,。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒分別對(duì)甲型流感病毒H1N1 亞型的HA 和NA 基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用一步法熒光 RT-PCR技術(shù)對(duì)甲型流感病毒 H1N1 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于科研實(shí)驗(yàn)中對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)檢測(cè),。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
IAV -H1N1 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
IAV -H1N1 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存,、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月,。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽,，取喉氣管、腦,、胸肌,、心肌和肺等組織；待檢活禽,，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,， 置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h,；若需長(zhǎng)期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過(guò) 3 次,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 提取,。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,， 請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑IAV -H1N1 反應(yīng)液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽(yáng)性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM、ROX,， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線,； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示,；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效,。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,；
3.陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變,、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段,。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服,；
6.樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理,。
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