甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus subtype N6 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
甲型流感病毒（Influenza A virus）為常見流感病毒,，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異,，甲型流感病毒的亞型則被人們稱為“禽-流感"，禽-流感(Bird Flu）是由禽-流感病毒引起的一種急性傳染病,，病毒基因變異后能夠感染人類,， 感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽,、流涕,、肌痛等，多數(shù)伴有嚴重的肺炎,，嚴重者心,、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高,。此病可通過消化道,、呼吸道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播,，人員和車輛往來是傳播本病的重要因素,。本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理,，檢測 N6 亞型流感病毒，對甲型流感病毒 N6 亞型引起的流感診斷有重要指導意義,。
【檢驗原理】
本試劑盒針對甲型流感病毒 N6 亞型 NA 基因高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，在反應體系中含甲型流感病毒 N6 亞型基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結果的定性、定量分析,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
IAV-N6 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
IAV-N6 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存,、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月,。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標本采集】
拭子樣品：采集咽喉拭子時將拭子每人喉頭及上顎裂來回刮 2 次~3 次并旋轉,，取分泌液；采集泄殖腔拭子時將拭子深人泄殖腔至少旋轉 3 圈并沾取少量糞便,；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液（配制方法見 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流感診斷技術）的 2 mL 采樣管中,，編號并填寫相應采樣單。
發(fā)病禽鳥可無菌采集氣管,、肺,、腦、腸（包括內(nèi)容物）,、肝,、脾、腎,、心等組織臟器,，裝入 15 mL 或 50 mL
帶螺口的有機材料保存管中，編號并填寫相應采樣單,。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h,；若需長期保存，應放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次,。,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
將棉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子,；糞便,，研碎的組織加 PBS 充分研磨，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液,。樣品液經(jīng) 3 000 r/min 離心 10 min,，取上清作為核酸檢測材料。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,， 請按照試劑說明書進行操作,。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑IAV-N6 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品,、陰性質控品各取 5μL,，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
4.2設置好通道,、樣品信息，反應體系設置為 25μL,；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,， 選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20,，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果,。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示,；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集,、處理,、運送以及保存質量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果,；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果,；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果,；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應液應避光保存,；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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