【產(chǎn)品名稱】
商品名稱： 禽-流-感病毒通用型（AIV-U）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name： Avian Influenza Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
禽-流-感是禽類流行型感冒的簡稱,，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽-流-感病毒)引起的一種急性傳染病,，經(jīng)變異后也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病,。禽-流-感病毒(AIV)為正粘病毒科甲型流感病毒屬,，單股 負鏈 RNA 病毒。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白可分為 H 亞型和 N 亞型,，目前已發(fā)現(xiàn) 18 個 HA 和 11 個 NA 亞型,。
本試劑盒適用于檢測拭子樣品、氣管,、肺,、腦、腸（包括內容物）,、肝,、脾、腎,、心等組織臟器中禽-流-感病 毒 RNA,，適用于禽-流-感病毒感染的診斷、檢疫,、檢測,、監(jiān)測和流行病學調查等。
【檢驗原理】
本試劑盒針對禽-流-感病毒 M 基因高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽-流-感病毒 RNA 進行體外擴增檢測,，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
AIV-U 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
AIV-U 陽性質控品50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。
【儲存條件及有效期】】
-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標本采集】
拭子樣品：采集咽喉拭子時將拭子每人喉頭及上顎裂來回刮 2 次~3 次并旋轉,，取分泌液；采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔至少旋轉 3 圈并沾取少量糞便,；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液（配制方法見 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感診斷技術）的 2 mL 采樣管中,，編號并填寫相應采樣單。
發(fā)病禽鳥可無菌采集氣管,、肺、腦,、腸（包括內容物）,、肝、脾,、腎,、心等組織臟器，裝入 15 mL 或 50 mL
帶螺口的有機材料保存管中,，編號并填寫相應采樣單,。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存,，應放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
將棉拭子充分捻動,、擠干后棄去拭子,；糞便，研碎的組織加 PBS 充分研磨,，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液,。樣品液經(jīng) 3 000 r/min 離心 10 min，取上清作為核酸檢測材料,。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取,，請按照試劑說明書 進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份）,，每測試反應體系配制如下表：
試劑AIV-U 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL /管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質控品,、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻,，
短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內,；
4.2設置好通道,、樣品信息，反應體系設置為 25μL,；熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM,，淬滅通道
（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20,，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結果,。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集,、處理、運送以及保存質量有關,；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果,；
6.試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；
7.本檢測結果僅供參考,，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行,；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存,；
4.反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。
【參考文獻】
[1] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感診斷技術[S].
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