【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：Diagnostic Kit for Novel duck reovirus RNA (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測全血,、血漿或血清、滑膜,、腱,、關(guān)節(jié)和心臟等標(biāo)本中新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）中的 RNA,，適用于幾種病毒感染的輔助診斷,。其檢測結(jié)果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對新型鴨呼腸孤病毒特異性引物,，結(jié)合一條特異性熒光探針,，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對新型鴨呼腸孤病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
NDRV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
NDRV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復(fù)凍融不超過 5 次,，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽，取滑膜,、腱,、關(guān)節(jié)或心臟組織；待檢活禽,，用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管,。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；全血樣品待血凝后取血清 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,， 請按照試劑說明書進(jìn)行操作,。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑NDRV 反應(yīng)液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；
熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM,，淬滅通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX
參比熒光,，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15,、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示,；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果,；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理,。
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