【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name ：Diagnostic Kit for ReticμLoen-dotheliosis Virus RNA (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的血清或血漿,、脾臟、肝臟,、腎臟,、疑似污染 REV 的活病毒疫苗等標本中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒 RNA，適用于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒感染的輔助診斷,。其檢測結果僅供參考,。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針,，用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒 RNA 進行體外擴增檢測,，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
REV 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
REV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存,、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月,。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標本采集】
疑似病雞的血清或血漿,；疑似病雞的脾臟、肝臟,、腎臟,；疑似污染 REV 的活病毒疫苗。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；全血樣品待血凝后取血清 100μL,，置于 1.5mL 離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取,，請按照試劑說 明書進行操作,。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑REV 反應液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
4.2設置好通道、樣品信息,，反應體系設置為 25μL,；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光,，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結果,。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。
5.3質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關,；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果,；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心,；
3.反應液應避光保存,；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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