【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：鵝細(xì)小病毒（GPV）核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)
Name：Diagnostic Kit for goose parvovirus DNA（Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預(yù)期用途】
鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒（Goose Parvovirus,，GPV）引起的雛鵝急性或亞急性、敗血性傳染病也叫小鵝瘟（Goose Plague,，GP）,。GPV 自然感染 1 月齡以內(nèi)雛鵝，雛番鴨也很易感染。鵝和番鴨是唯-一可自然感染本病的禽類,。10~13 日齡以內(nèi)雛鵝的發(fā)病率和死亡率常高達(dá) 95%~100%,，15 日齡以上雛鵝的發(fā)病率和死亡率有所下降，40 日齡以上只有個(gè)別發(fā)病死亡,。成年鵝感染后不顯癥狀而成為帶毒者,，可能將疾病垂直傳播至下一代。所有日齡鵝對(duì) GPV 都有免疫學(xué)反應(yīng),，但成年鵝不表現(xiàn)臨床癥狀,。近年來(lái)流行的鵝細(xì)小病毒病，患病鵝發(fā)病日齡有增大傾向,。
本試劑盒適用于檢測(cè)水禽類心臟,、肝臟、脾臟等組織樣本及糞便樣本中的鵝細(xì)小病毒,，用于鵝細(xì)小病毒感染的輔助診斷,，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),，設(shè)計(jì)一對(duì)鵝細(xì)小病毒病毒特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)鵝細(xì)小病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
GPV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
GPV 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,，有效期 12 個(gè)月,。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。
【標(biāo)本采集】
對(duì)于死亡水禽,，可直接采集心臟、肝臟,、脾臟等組織,，于 0℃ ~4℃冷藏保存并立即送檢，采樣過(guò)程中樣品不得交叉污染[1],。
對(duì)于活水禽,，可直接采集糞便。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h,；若需長(zhǎng)期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過(guò) 3 次,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
死亡水禽,，剖檢取心臟、肝臟,、脾臟等組織,，可單獨(dú)使用，也可混合使用,。各組織剪碎后研磨成糊狀,，按
1:5 加入生理鹽水，將混懸液收集于離心管內(nèi),，-20℃反復(fù)凍融三次,，以 6000g 離心 5min，取上清液待檢[1]
活禽,，取糞便于 1×PBS 中,，混勻后瞬時(shí)離心，取上清,。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,， 請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；樣品每滿
10 份，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑GPV 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽(yáng)性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值,。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示,；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過(guò)程中沒有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,；
3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
6.試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；
6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1]江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局,，DB32/T 1460-2009,鵝細(xì)小病毒的檢測(cè) PCR 方法[S]
[2]遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,，《禽病學(xué)》第 14 版（譯），ISBN 978-7-5591-2094-6,，中國(guó)版本圖書館 CIP 數(shù)據(jù)核字
（2023）第 110085 號(hào)
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