雞白痢/雞傷寒沙門(mén)氏菌（SP/SG）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：雞白痢/雞傷寒沙門(mén)氏菌（SP/SG）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：S.Gallinarum-Pullorum Nucleic Acid Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預(yù)期用途】
由沙門(mén)氏菌屬的某些致病性沙門(mén)氏菌引起的雞群細(xì)菌性傳染病稱為雞沙門(mén)氏菌病,，一般分為雞白痢、雞傷寒和副傷寒三種病型,，其中以雞白痢和雞傷寒發(fā)病較多,，危害較強(qiáng)。雞白痢是由雞白痢沙門(mén)氏菌（S.Pullorum）感染雞群引起的,，主要是侵害雛雞,。2 周以下的雛雞發(fā)病后死亡率可達(dá) 40%-70%，受感染的雛雞在 4-7 天死亡,，急性時(shí)可在 1-3 天死亡,。雞傷寒沙門(mén)氏菌（S.Gallinarum）感染雞群可引起雞傷寒病癥，主要是感染成年雞,，雛雞有時(shí)也會(huì)被感染,， 出殼后幾天開(kāi)始發(fā)病， 死亡率較高。 現(xiàn)在,， 這兩種致病菌統(tǒng)稱為雞- 雛沙門(mén)氏
（S.Gallinarum-Pullorum）,，沒(méi)有鞭毛，不會(huì)運(yùn)動(dòng),，只會(huì)感染雞群,，可存在于卵巢、睪丸,、肝臟等器官中,，能夠通過(guò)親代感染子代，因此對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害極大,。
本試劑盒適用于肝臟,、脾臟等組織樣品以及腸內(nèi)容物樣品，糞便樣品,，泄殖腔拭子樣品等樣品中的雞白痢/ 雞傷寒沙門(mén)氏菌，用于雞白痢/雞傷寒沙門(mén)氏菌感染的輔助診斷,。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),，設(shè)計(jì)一對(duì)雞白痢/雞傷寒沙門(mén)氏菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)雞白痢/雞傷寒沙門(mén)氏菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
SP/SG 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
SP/SG 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用,。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。
【標(biāo)本采集】
組織樣品：選擇具有典型臨床癥狀的病死雞，無(wú)菌取其肝臟,、脾臟等組織樣品,，放置于無(wú)菌容器內(nèi)，標(biāo)記好 組織名稱和采樣日期,，冷藏運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),。
肛拭子樣品：采集肛拭子樣品時(shí)，取無(wú)菌棉拭子插入畜禽肛-門(mén)或泄殖腔中，旋轉(zhuǎn) 2 圈~3 圈,，刮取直腸黏液或糞便,，放入裝有 30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢。
腸內(nèi)容物樣品：取腸內(nèi)容物時(shí),，應(yīng)燒烙腸壁表面,，用吸管中扎穿腸壁。從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物放入盛有滅菌的
30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢或?qū)в屑S便的腸管兩端結(jié)扎,，從兩端剪斷送檢,。
糞便樣品：應(yīng)選新鮮糞便至少 10g，運(yùn)送糞便樣品可用帶螺帽容器或滅菌塑料袋,，不得用帶皮塞的試管,。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h；若需長(zhǎng)期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存,，凍融不超過(guò) 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從不同的位置稱取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；水樣便 13000rpm 離心 2min,，去盡上清,；其它樣品處理參考 NY/T541-2016。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,，請(qǐng) 按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份），每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑SP/SG 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇：檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX
參比熒光，選擇 None 即可,。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果,。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值,。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效,。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集,、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3.陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變,、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；
6.樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 40049-2021 雞腸炎沙門(mén)氏菌 PCR 檢測(cè)方法[S]
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