新型鵝細小病毒（NGPV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：新型鵝細小病毒（NGPV）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name：Diagnostic Kit for Novel goose parvovirus DNA（Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預期用途】
新型鵝細小病毒（Novel goose parvovirus, NGPV）屬細小病毒科（Parvoviridae）、細小病毒亞科（Parvovirinae）,、依賴病毒屬（Dependovirus）,。新型鵝細小病毒病是由新型鵝細小病毒（novel goos e parvovirus，NGPV）引起的一種病毒性傳染病,，又稱短喙侏儒綜合征（short beak and dwarfism syndrome,，SBDS），主要感染櫻桃谷北京鴨,、番鴨,、半番鴨等。臨床表現(xiàn)為短喙,、舌頭外伸,、腿骨易折斷、生長發(fā)育受阻,、死亡等典型的 SBDS 癥狀,， 發(fā)病率高但死亡率低。
本試劑盒適用于檢測水禽類心臟,、肝臟,、脾臟等組織樣本及糞便樣本中的新型鵝細小病毒，用于新型鵝細小病毒感染的輔助診斷,，其檢測結果僅供參考,。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,，設計一對新型鵝細小病毒病毒特異性引物，結合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術對新型鵝細小病毒的核酸進行體外擴增檢測,，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
NGPV 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
NGPV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標本采集】
對于死亡水禽，可直接采集心臟,、肝臟,、脾臟等組織，于 0℃ ~4℃冷藏保存并立即送檢,，采樣過程中樣品不得交叉污染[1],。
對于活水禽，可直接采集糞便,。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h,；若需長期保存，應放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
死亡水禽，剖檢取心臟,、肝臟,、脾臟等組織，可單獨使用,，也可混合使用,。各組織剪碎后研磨成糊狀，按
1:5 加入生理鹽水,，將混懸液收集于離心管內(nèi),，-20℃反復凍融三次，以 6000g 離心 5min,，取上清液待檢[1]
活禽,，取糞便于 1×PBS 中,，混勻后瞬時離心，取上清,。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；樣品每滿
10 份，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：
試劑NGPV 反應液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
4.2設置好通道,、樣品信息,，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示,；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關,；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果,；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應液應避光保存,；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。
【參考文獻】
[1]江蘇省質(zhì)量技術監(jiān)督局,，DB32/T 1460-2009,鵝細小病毒的檢測 PCR 方法[S]
[2]遼寧科學技術出版社，《禽病學》第 14 版（譯），ISBN 978-7-5591-2094-6,，中國版本圖書館 CIP 數(shù)據(jù)核字
（2023）第 110085 號
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