禽腺病毒 I 群（FADV-I）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：禽腺病毒 I 群（FADV-I）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：I group of Fowl Aviadenovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒
【預(yù)期用途】
I 群禽腺病毒（I group of Fowl Aviadenovirus Detection Kit）是無囊膜,、線性雙股 DNA 病毒,屬于腺病毒科、禽腺病毒屬成員,。該病毒可感染雞,、火雞及其他禽類。FADV-I 可致雞發(fā)生包涵體肝炎,、心包積水綜合征和肌胃糜爛等疾病,。該病常與禽類其他病原混合感染,感染雞只可繼發(fā)再生障礙性貧血、肝炎及產(chǎn)蛋量下降等,。
本試劑盒適用于檢測心臟,、肝臟、脾臟,、腎臟,、腺胃、胸腺,、胰腺,、法氏囊、腦和泄殖腔拭子樣品等樣本中的 I 群禽腺病毒,，用于 I 群禽腺病毒感染的輔助診斷,。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對 I 群禽腺病毒特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術(shù)對 I 群禽腺病毒的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷,。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
FADV-I 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
FADV-I 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
【標(biāo)本采集】
病死禽、撲殺禽心臟,、肝臟,、脾臟、腎臟、腺胃,、胸腺,、胰腺、法氏囊,、腦等組織,；待檢活禽活，取泄殖 腔拭子,，放于 1mL 50%甘油生理鹽水中
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h,；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次,。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后,，于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；泄殖腔拭子直接取 100μL 提取,。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,， 請按照試劑說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；樣品每滿
10 份,，多配制 1 份),，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑FADV-I 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管,。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,， 短暫離心,。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX
參比熒光,，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15,、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示,；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足,，否則實驗視為無效,。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理,、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；
3.陽性對照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；
4.病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；
5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。
【注意事項】
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心,；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；
5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染,；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理,。
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