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過氧化氫酶（Catalase,，CAT）試劑盒(紫外吸收法)說明書

微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用,。

測定原理：

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰,，CAT能夠分解H₂O₂，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時間而下降,，根據(jù)吸光度的變化率可計算出CAT活性,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽,、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存；

工作液：液體24mL×1瓶,，4℃保存,；

粗酶液提取：

1,、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至240nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、   測定前將CAT檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。

3、   準備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板,，普通酶標(biāo)板只能透過可見光,，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務(wù)必使用UV板）,。

4、   在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL工作液,，混勻,，記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計算ΔA＝A1-A2,。

注意事項：出現(xiàn)負值怎么辦,？

首先檢查吸光值是否超過3，如果超過3很可能是沒有用UV板,，請換用UV板,。如果未超過3，仍然出現(xiàn)負值則檢查反應(yīng)過程是否產(chǎn)生氣泡,，氣泡多說明酶活性太高,，氣泡影響產(chǎn)生了負值,，可以將樣本用提取液稀釋10倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒有產(chǎn)生氣泡仍然出現(xiàn)較小的負值,，說明該樣本測不到該酶活,。

CAT活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=459×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T =0.917×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，4.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細胞或細菌總數(shù),，500萬。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1,、血清（漿）CAT活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=918×ΔA

2、組織,、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=918×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位,。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.836×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù),，4.36×10⁴ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細胞或細菌總數(shù),，500萬。

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