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二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）試劑盒說明書

                                                     微量法100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物（腸粘膜,、肺、肝臟,、腎臟等）,、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛,，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān),，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。

測定原理：

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫,，外源添加過量的辣根過氧化物酶,，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在460nm處有特征吸收峰,，通過測定該波長吸光度增加速率,，計算DAO活性。

自備實驗用品及儀器：

天平,、低溫離心機,、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,、蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體0.3mL×1支,，4℃保存。

試劑二：液體2.5mL×1瓶,，4℃保存。

試劑三：液體1.2mL×1管,，4℃保存,。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后10000g，4℃離心20min,，取上清,，置冰上待測,。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后10000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定,。

測定操作表：

1,、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至460nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、操作表

酶活性計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下,，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下,，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A₄₆₀÷W

（3）按細胞數(shù)量計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下,，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T= 18×A₄₆₀÷細胞數(shù)量

(4) 按液體體積計算

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下,，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL,；V樣：反應(yīng)中樣本體積,，0.05mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時間,，30min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個酶活力單位（U）,。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位,。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A₄₆₀÷W

（3）按細胞數(shù)量計算：

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位,。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T= 36×A₄₆₀÷細胞數(shù)量

(4) 按液體體積計算

酶活性定義：在pH7.2,，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位,。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 36×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L /mmol/cm,；d：96孔板光徑，0.5cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積,，0.05mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時間，30min

注意事項：

1,、如果OD值小于0.01，適當(dāng)加大提取用樣本量,；OD值大于0.8,，粗酶液可適當(dāng)稀釋,，或者減少提取用樣本量。

2,、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定,。

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