多功能氧化酶（(mixed function oxidase,，MFO）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
多功能氧化酶又稱混合功能氧化酶,，可產(chǎn)生降解反應(yīng)，可使原化學物質(zhì)變?yōu)榈投镜幕驘o毒的物質(zhì)從體內(nèi)排出,；還可產(chǎn)生激活反應(yīng),，可使原化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親電子性質(zhì)，導(dǎo)致毒性增強,，成為致突變物或終致癌物,。近年來對混合功能氧化酶系與外源性化學物質(zhì)相互作用的深入研究，對于從分子生物學水平上進一步了解外源性化學物質(zhì)的毒作用具有重要意義,。
測定原理：
MFO催化對硝基苯甲醚產(chǎn)生對硝基苯酚,，在400nm下有特征吸光值。
自備用品：
酶標儀,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、96孔板,、研缽,、冰、蒸餾水,、氯仿,。
試劑組成和配制：
提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體24mL×1瓶,，4℃避光保存;
試劑二：粉劑×3管,，-20℃保存；臨用前取一管加入1.5mL水溶解,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。
試劑三：液體24mL×1瓶，4℃保存;
試劑四：液體64mL×1瓶,，4℃保存,。
粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。12000g 4℃離心20min，取上清,，置冰上待測,。
測定步驟：
1、 酶標儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至400nm,。
2、在EP管中依次加入如下試劑
試劑名稱（μL） | 測定 | 空白 |
試劑一 | 200 | 200 |
試劑二 | 40 | 40 |
提取液 | 160 | 360 |
樣本 | 200 | |
混勻,，37℃水浴30min | ||
試劑三 | 200 | 200 |
分別加入1000μL氯仿,，充分混勻萃取，靜置10min,，取下層氯仿層0.6mL至新的EP管中,。再加入試劑四0.6mL，充分混勻萃取,，取上層水相0.2mL于96孔板中,，400nm下測定吸光值A測定與A空白，△A=A測
定-A空白,?？瞻坠苤恍铚y一管。
MFO活性計算:
標準曲線：y = 0.0119x + 0.0021,，R2 = 0.9997,；y，吸光度,；x,標準品濃度,，單位nmol/mL。
（1）按樣本質(zhì)量計算
單位定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。
MFO（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。
MFO（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣×Cpr)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷Cpr
V總：最終萃取液體積，0.6 mL,；V樣：反應(yīng)中樣品體積,，200μL；T：反應(yīng)時間,，30min,；W：樣品質(zhì)量，g,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,。
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