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蛋白質(zhì)羰基含量測定試劑盒

 微量法100T/48S

注   意 ：正式實驗之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標志,，其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標,。

測定原理：

羰基與2,4-er硝基苯肼反應(yīng)生成紅色2,4-er硝基苯腙,，在370nm處有特征吸收峰,。

自備實驗用品及儀器：

天平、恒溫水浴鍋,、低溫離心機,、漩渦震蕩儀、可見分光光度計/酶標儀,、微量石英比色皿/96孔板,、蒸餾水、無水乙醇,、乙酸乙酯,。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：粉劑0.1g×5支,，4℃避光保存。（使用前根據(jù)樣品數(shù),，每支加1mL水溶解,，每支為10個樣品用量）

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存,。

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存,。

試劑四：液體15mL×1瓶,，4℃保存。

試劑五：根據(jù)測定樣品量,，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合,。

試劑六：液體60mL×1瓶，4℃保存,。

樣品處理：

1.        組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，于4℃,，4000g離心10min,，取上清，加入0.1mL試劑一,，室溫放置10min,，4℃，10000g離心10min,，取上清待測,。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后10000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3.        血清等液體樣本：直接測定。

測定步驟和操作表：

1,、   分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至370nm。

2,、   操作表

計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.        按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA₃₇₀÷Cpr

2.        按照樣本重量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA₃₇₀÷W

3. 按照細胞數(shù)量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA₃₇₀÷細胞數(shù)量

4.        按照液體體積計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA₃₇₀

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù),，22 L/mmol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.06 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL，W：樣本質(zhì)量,，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA₃₇₀÷Cpr

2. 按照樣本重量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA₃₇₀÷W

3. 按照細胞數(shù)量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA₃₇₀÷細胞數(shù)量

4. 按照液體體積計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.454×ΔA₃₇₀

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù),，22 L/mmol/cm,；d：96孔板光徑，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,，W：樣本質(zhì)量,，g

注意事項：

1. 試劑一使用前根據(jù)要測定的樣品數(shù)現(xiàn)配，配置好后4℃保存,，若變?yōu)楹谏?，則不能使用,。

2. 試劑二見光易分解,，反應(yīng)需嚴格避光。

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