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單寧酶（Tannase,，TAN）試劑盒說明書

                                       微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase,，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,，生成沒食子酸和葡萄糖,。

測(cè)定原理：

使用抗氧化劑沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，在270nn下測(cè)定底物PG反應(yīng)前后的光密度變化,計(jì)算單寧酶酶活力,。

需自備的的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽,、冰,、蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×2瓶，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1支,，4℃保存；臨用前每支加入6mL試劑一,，充分溶解后備用,；用不完的試劑4℃保存；

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）,，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

液體樣本：直接取上清測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到270 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2,、加樣表

混勻，40℃準(zhǔn)確保溫10 min后,，置95℃水浴中10 min（蓋緊,，防止水分散失），冷卻

混勻,，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中,，270nm處讀取各管吸光值。計(jì)算ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定,。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管,。

注意：

1.可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理,。

2.務(wù)必使用96孔UV板（非普通酶標(biāo)板,，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光,，檢測(cè)波長小于340nm務(wù)必使用UV板）,。

TAN活力單位的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994,；x為PG含量（µmol/L）,，y為吸光值。

1,、按樣本體積計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位,。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T

=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U),。

TAN活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3,、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，1mL,； V樣：加入樣本體積，0.05mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044,，R2 = 0.9994,；x為PG含量（µmol/L），y為吸光值,。

1,、按樣本體積計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）

2,、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U),。

TAN活性(µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U),。

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，1mL； V樣：加入樣本體積,，0.05mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

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