超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說明書（WST-8 法）
微量法 100 管/96 樣
注 意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,，也是 H2O2 主要生成酶,，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
測定原理：
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-),，O2-可與 WST-8 反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜,，后者在 450nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-,，從而抑制了甲臜的形成,；反應(yīng)液黃色越深，說明 SOD 活性愈低,，反之活性越高,。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、離心機(jī),、移液器,、96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存；
試劑一：液體 20mL×1 瓶,，4℃避光保存,；
試劑二：液體 150μL×1 支，4℃避光保存,；
試劑三：液體 100μL×1 支,，4℃保存,；
試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存,。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。
2,、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1,、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 450nm。
2,、 試劑三的稀釋：將試劑三用蒸餾水稀釋 50 倍,，用多少配多少。（試劑三和蒸餾水 1：49稀釋,。
3,、 工作液配制：在試劑一加入 100μL 試劑二，充分混勻,。配好的試劑 4℃避光可保存一周,。（若一次性測定樣本較少，可按照實際用量將試劑一和試劑二按照 20mL：0.1mL 的比例混勻配制）
4,、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完）,。
5,、 樣本測定（在 96 孔板中依次加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 10 | |
蒸餾水 | 10 | |
試劑三（稀釋后） | 10 | 10 |
工作液 | 160 | 160 |
試劑四 | 20 | 20 |
充分混勻，室溫靜置 30min 后,，450nm 處測定各管吸光值 A,。
注意事項：
1、試劑三為酶,，不可冷凍,，使用時在冰上放置。
2,、對照管只需要做一管,。
3、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管,，對照管數(shù)值在什么范圍,？
對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是（1）試劑三活性低,，可以適當(dāng)減少稀釋倍數(shù),；（2)沒有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時間不夠,，可以延長反應(yīng)時間（反應(yīng)時間 30min可以延長到 40min）,。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。若出現(xiàn)測定管大于對照管,，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大,，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測，通?？梢允箿y定正常,。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
SOD 活性計算：
1,、抑制百分率的計算
抑制百分率＝(A 對照管－A 測定管) ÷A 對照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi),。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定,。如果測定出來的抑制百分率偏高,，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低,，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本,。
2、SOD 酶活性單位：
3,、在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時,，反應(yīng)體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。
3,、SOD 酶活性計算：
（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)
（2）組織,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 SOD 活力計算：
a.按樣本蛋白濃度計算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)
=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
b.按樣本鮮重計算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W
c.按細(xì)菌或細(xì)胞個數(shù)計算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)
=0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)
V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL,；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL,；
V 樣總：加入提取液體積,，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL ,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬。
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