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線粒體轉氫酶-2（TH-2）試劑盒說明書

                                      微量法100管/96樣

注  意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

TH位于線粒體的內膜上,，又稱為線粒體復合體六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉化,，調節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡,。把逆向反應稱為TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH,。

測定原理：

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,，因此TH催化的轉氫反應不能導致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺,，TH-2催化APAD⁺還原生成APADH,，APADH在375nm有特征光吸收，測定375nm光吸收的增加速率,，來計算TH-2活性,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機,、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑二：液體50mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：液體18mL×1瓶,，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支,，-20℃保存,；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

②        將勻漿600g，4℃離心5min,。

③        棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心10min,。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的TH-2（此步可選做）,。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入500uL試劑二，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10秒,，重復30次）,，用于TH-2活性測定。

測定步驟：

1,、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至375nm，蒸餾水調零,。

2,、  樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑四,、五轉移到試劑三中混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,，混勻,，立即記錄375nm處初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

TH-2活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。

 TH-2活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。

TH-2活性（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L；ε：APADH摩爾消光系數,，6.7×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.5mL,；T：反應時間，10 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL；W：樣本質量,，g,；500：細菌或細胞總數，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。

 TH-2活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。

TH-2活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L；ε：APADH摩爾消光系數,，6.7×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.5mL,；T：反應時間,，10 min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL；W：樣本質量,，g,；500：細菌或細胞總數，500萬,。

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