線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶,，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C的氧化,，并最終把電子傳遞給氧,，生成水。
測定原理：
還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收,，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C,，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存；
試劑二：液體20mL×1瓶,，-20℃保存,；
試劑三：液體1.5mL×1瓶,，-20℃保存；
試劑四：液體20mL×1瓶,，4℃保存,；
試劑五：粉劑×1支，-20℃保存,；
試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1,、 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
2、 將勻漿600g,，4℃離心5min,。
3、 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11100g，4℃離心10min,。
4,、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選做）,。
5,、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復30次），用于復合體Ⅳ酶活性測定,。
測定步驟：
1,、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2、 樣本測定
（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和200μL工作液,，混勻,，記錄550nm處初始吸光值A1和 37℃反應(yīng)30min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2,。
注意點：
1,、若ΔA大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當倍數(shù)（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，使A1-A2小于0.2,，可提高檢測靈敏度。
2,、動物肝臟樣本由于酶活性過高,， 1分鐘內(nèi)吸光值就會到達平臺期，務(wù)必先進行2個樣本的預(yù)測定,。可將樣本用試劑二稀釋10~50倍,，反應(yīng)時間縮到到30秒或1分鐘（計算公式中代入實際反應(yīng)時間,，并乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測定步驟進行,。
復合體Ⅳ活力單位的計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.008×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L,；ε：細胞色素C摩爾消光系數(shù),，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時間,，30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬,。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.76×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位,。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.016×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L,；ε：細胞色素C摩爾消光系數(shù),，1.91×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時間,，30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細胞或細菌總數(shù),，500萬,。
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