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線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,，廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH₂,，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,，是呼吸電子傳遞鏈的支路。

測定原理：

復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚,，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑三：液體1.5mL×1支,，-20℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存,；

試劑六：液體2.5mL×1瓶,，4℃保存；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、   準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2、   將勻漿600g,，4℃離心5min,。

3、   棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。

4,、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選做）,。

5,、   步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測定,。

測定步驟：

1,、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、  樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、25μL試劑六和200μL工作液,，立即混勻，記錄

605nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

 復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=113×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =0.226×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.35×10^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬,。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

 復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1118×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

 復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=226×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.452×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.35×10^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬,。

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