線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物,。該酶催化一對電子從NADH傳遞給CoQ,，同時可使O2還原生成O2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位,。測定該酶活性,，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài),。
測定原理：
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD+,，在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存,；
試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存,；
試劑三：液體1.5mL×1瓶,，-20℃保存；
試劑四：液體25mL×1瓶,，-20℃保存,；
試劑五：液體1mL×1支，-20℃保存,；
試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存，用時加入2mL蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。
工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
② 將勻漿600g,，4℃離心5min。
③ 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測定,。
測定步驟：
1,、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2、 樣本測定
（1）工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、200μL工作液和15μL試劑六，混勻,，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2,。
復(fù)合體Ⅰ活力單位的計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=365×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=730×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.25×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，2 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬,。
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