單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測(cè)定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。
測(cè)定意義：
MDHAR催化MDHA還原生成AsA,，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測(cè)定原理：
MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰,，但是NAD+沒有,。通過測(cè)定340 nm光吸收下降速率，來計(jì)算出MDHAR活性,。
實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：
研缽,、冰、臺(tái)式離心機(jī),、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水
試劑組成和配置：
試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑二：液體20mL×1瓶，室溫保存,。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色）,，4℃保存,。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解,。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解,。
試劑五：液體15μL×1瓶，4℃保存,。臨用前加3 mL試劑二充分溶解,。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g，4℃離心10min,，取上清置冰上待測(cè),。
2. . 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；8000g ，4℃離心20min,，取上清液置冰上混勻待測(cè),。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
MDHAR測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL試劑三,、20μL試劑四,、20μL試劑五和120μL試劑二，最后加入20μL上清液,，迅速混勻后于340nm比色,，記錄30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2,。
MDHAR活性計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷（Cpr×V樣）÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。
MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 804×△A ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T
= 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣）÷T
= 804×△A
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL=2×10-4L,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL,；V樣總：提取液體積,，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度,，mg/mL,，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒,；W ：樣品質(zhì)量,；T：反應(yīng)時(shí)間，2min,。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷（Cpr×V樣）÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。
MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 1608×△A ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T
= 1608×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣）÷T
=1608×△A
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL,，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；W ：樣品質(zhì)量,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2min。
注意事項(xiàng)：
臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存,，3天內(nèi)使用完,。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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33.5KB | 資料類型 |
WORD 文檔 |
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