L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑,。Gal LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)AsA生物合成的最后一步,，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一,，對植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。
測定原理：
Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素C(Cyt c),，還原型Cyt c在550nm有吸收峰,；測定還原型Cyt c增加速率，來計(jì)算Gal LDH活性,。
自備儀器和用品：
臺式離心機(jī),、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,、可調(diào)式移液器,、研缽、冰和蒸餾水,。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存,。臨用前加入16mL蒸餾水,，充分溶解。
試劑三：粉劑×1管,，4℃保存,。臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解,。
粗酶液提?。?/span>
照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。13000g，4℃離心10min,，取上清置冰上待測,。
Gal LDH測定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到550nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3.依次在,、微量玻璃比色皿/96孔板中加入20μL上清液,、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于550nm比色,，記錄10s和130s的吸光值A1和A2,，△A = A2﹣A1。
Gal LDH活性計(jì)算公式：
使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位,。
Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（Cpr×V樣）÷T
=578×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位,。
Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（W×V樣÷V樣總）÷T
=578×△A ÷W
ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×103L/ mol/cm,；d：96孔板光徑(cm),，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL=0.0002 L,；109：1mol=1×109nmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL=0.02mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；Cpr：上清液蛋白濃度,，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2min。
注意事項(xiàng):
試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完,。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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資料大小 |
28.5KB | 資料類型 |
WORD 文檔 |
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