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脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate,，DHA）含量測定試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

測定意義：

AsA作為植物細胞一個重要生理指標，其AsA 的含量,、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關酶類活性的變化涉及植物對一系列環(huán)境脅迫的響應,。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi),，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng),，具有電子受體的作用。

測定原理：

DTT還原DHA生成AsA,，通過測定體系中AsA的生成速率,，即可計算出DHA含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機,、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）,、可調(diào)式移液器,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶,，室溫保存。

試劑二：液體16mL×1瓶,，室溫保存,。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解,。

標準品：粉劑×1瓶,， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解,；吸取0.1 mL上述溶液,，加入0.9 mL蒸餾水，混勻,，即為100μmol/L DHA,。

樣品中DHA提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿,。12000g，4℃離心20min,，取上清置冰上待測,。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；12000g，4℃離心10min,，取上清液置于冰上待測,。

3. 血清等液體：直接測定。

DHA測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到265 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min,。

3. 標準管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL標準液,、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色,，記錄10s和130s的吸光值A1和A2,，△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液,、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三,，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4,，△A測定管=A4-A3,。

注意：標準管只需測定一次。

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標準管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標準管

C標準液：100μmol/L；V樣總：上清液總體積,，1.0 mL=1 ×10^-3 L,；V標準：加入標準品體積，0.02mL,；V樣：加入樣本體積,，0.02mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣品質(zhì)量（g）。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標準管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標準管

C標準液：100μmol/L,；V樣總：上清液總體積,，1.0 mL=1×10^-3 L；V標準：加入標準品體積,，0.02mL,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）,。

注意事項：

1.        臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存,，3天內(nèi)使用完。

2.        Z低檢出限為10μmol/L,。

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