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錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase,，Mnp）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

測(cè)定意義：

錳過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，主要存在于擔(dān)子菌中,，屬于木質(zhì)素降解酶系,，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物,、DTT,，多環(huán)芳烴等。

測(cè)定原理：

錳過(guò)氧化物酶在Mn2+存在的條件下,，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚,，在465nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平,、研缽、低溫離心機(jī),、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體110mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1支,，4℃保存,。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃避光保存,。

試劑四：液體2mL×1支,，4℃保存。

酶液提?。?/p>

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃,，10000g離心10min,，取上清置于冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；然后4℃,，10000g離心10min,，取上清置于冰上待測(cè),。

3.        培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1,、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至465nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、  測(cè)定前將試劑一、二,、三,、四在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上。

3,、  樣本測(cè)定表

在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑,，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄465nm下30s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min30s后的吸光值A(chǔ)2,。計(jì)算ΔA＝A2-A1,。

注意：若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一,、二,、三、四按比例配成混合液,，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上,，測(cè)定時(shí)加入20µL樣本和180µL混合液測(cè)定。

酶活計(jì)算公式：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 413×ΔA÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 413×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 413×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4 L,；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2min

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 826×ΔA÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 826×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 826×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積,，2×10-4 L,；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時(shí)間，2min

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