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莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase,，SD）試劑盒說明書

                                         微量法 100管/96樣

注    意： 正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

莽草酸途徑是存在于植物,、真菌和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸合成途徑中的關(guān)鍵酶,。

測定原理：

莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產(chǎn)生NADPH,，檢測340nm下的吸光值增加速率來表示SD活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存,；

粗酶液提?。?/span>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

測定步驟：

1,、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、   樣本測定

（1）在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻,，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,，混勻,，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

SD活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

SD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01mL；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

SD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬。

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