組織無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。
測(cè)定意義：
無(wú)機(jī)磷主要指磷酸根,，參與生物體內(nèi)多種代謝,，包括能量代謝、核酸代謝,、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化等等,，此外促進(jìn)碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn),。
測(cè)定原理：
鉬藍(lán)與磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物質(zhì),，通過(guò)測(cè)定660nm光吸收，即可計(jì)算無(wú)機(jī)磷含量,。
自備儀器和用品：
離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液槍,、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水,。
試劑組成和配置：
試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存。
試劑二：液體5mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存,。臨用前配制,，加入10 mL蒸餾水，充分溶解后加入試劑二（全部）,，混勻,。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支。
無(wú)機(jī)磷提?。?/span>
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm,，4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。
測(cè)定：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm，蒸餾水調(diào)零,。
2.打開(kāi)水浴鍋,，調(diào)節(jié)溫度到40℃。
3. 空白管：取0.5mL EP管,，依次加入100μL蒸餾水,，100μL試劑三,，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度,，記為A空白管,。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管,，依次加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液,，90μL蒸餾水，100μL試劑三,，混勻后置于40℃水浴保溫10min,，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管,。
5. 測(cè)定管：取0.5mL EP管,，依次加入10μL上清液，90μL蒸餾水,，100μL試劑三,，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度,，記為A測(cè)定管,。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
組織無(wú)機(jī)磷含量計(jì)算：
（1） 按照蛋白含量計(jì)算
無(wú)機(jī)磷含量(μmol/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷Cpr
=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
無(wú)機(jī)磷含量(μmol/g 鮮重 )= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W
=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)液：1mmol/L,；V總：上清液總體積,，1mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量,，g,。
注意事項(xiàng)：
1. 試劑三需臨用前配制，并且當(dāng)天使用完畢,。
2. 40min內(nèi)完成比色,。
3. Z低檢出限為10μmol/L。
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