硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
TPX屬于過氧化物酶家族,，在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,，功能與GPX類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一,。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母,、植物,、動物、原生動物,、寄生蟲,、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守,。TPX與細(xì)胞增殖,、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān),。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒,、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。
測定原理：
TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇（DTT）,，H2O2的吸收波長為240nm,，通過測定240nm吸光度的下降速率，即可計算出TPX活性,。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器,、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一：液體120mL×1瓶,，室溫保存,。
試劑二：液體20mL×1瓶，- 20℃保存,。
試劑三：液體2mL×1支,，4℃。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定,。
TPX測定操作：
取微量石英比色皿或96孔板,，加入4 μL上清液，180 μL試劑二,，16 μL試劑三,，迅速混勻后于240 nm測定10s和130s吸光度，記為A1和A2,。
TPX活性計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
=573×(A1－A2)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1－A2)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=573×(A1－A2)
ε：H2O2的摩爾消光系數(shù),，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200 μ L=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL）,，4 μL=4×10-3 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間（min），2min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
=1146×(A1－A2)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1146×(A1－A2)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1146×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位,。
TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=1146×(A1－A2)
ε：H2O2的摩爾消光系數(shù)，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L）,，200 μL=2×10-4 L,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL）,，4 μ L=4×10-3 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時間（min），2min,。
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