谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,，GST）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價(jià)結(jié)合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),，易于從膽汁或尿液中排泄,，達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此,，GST在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,。此外，因?yàn)?/span>GST具有GSH-Px活性,，亦稱為non-Se GSH-Px,，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能,。注意,，GST催化的反應(yīng)減少GSH含量，但是不增加GSSG含量,。
測定原理：
GST催化GSH與CDNB結(jié)合,，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm；通過測定340nm波長處吸光度上升速率,，即可計(jì)算出GST活性,。
自備儀器和用品：
低溫離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)節(jié)移液器,、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水,。
試劑組成和配置：
試劑一：液體120mL×1瓶,，4℃保存。
試劑二：液體22mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加2 mL蒸餾水溶解,。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時(shí)間3min）；然后8000g,，4℃,，離心10min，取上清置于冰上待測,。
3. 血清等液體：直接測定,。
測定：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm,，用蒸餾水調(diào)零,。
2. 試劑三放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫。
3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板,，加入20μL上清液,，180μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定吸光度變化,，記錄10 s和310 s吸光度為A1和A2,。
GST活性計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=230×(A2-A1) ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=230×(A2-A1)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=230×(A2-A1) ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。
GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T
= 230×(A2-A1)
ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),，9.6×103 L/mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；106：1mol=1×106μmol,；V反總：反應(yīng)體系總體積，220μL=2.2×10-4 L,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL,；V樣總：提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，5min,。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=460×(A2-A1) ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。
GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=460×(A2-A1)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=460×(A2-A1)÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位,。
GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T
=460×(A2-A1)
ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),，9.6×103 L/mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；106：1mol=1×106μmol；V反總：反應(yīng)體系總體積,，220μL=2.2×10-4 L,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定,，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL,；V
樣總：提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，5min,。
注意事項(xiàng)：
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力,；
2. 細(xì)胞中GST活性測定時(shí),，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GST的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,；
3. 本法測定GST活性的線性范圍可達(dá)76 μmol/min /L，測定前先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),，如5min內(nèi)反應(yīng)不成線性,，須對樣品用蒸餾水稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),；
4. 測定反映的溫度對測定結(jié)果有影響，請控制在25℃或者37℃（哺乳動物）,。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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