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氧化型谷胱甘肽含量測定試劑盒說明書

                                              微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GSH/GSSG是細胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一,。因此,，測定細胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài),，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標(biāo)之一。

測定原理：

利用2-VP法測GSSG含量,。

自備儀器和用品：

低溫離心機,、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器,、可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水,。

試劑組成和配置：

試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：液體600μL×1支,，4℃保存,。

試劑三：液體50mL×1瓶，4℃保存,。

試劑四：液體2.5mL×1瓶,，4℃保存。

試劑五： 液體15μL×1瓶,，-20℃保存,。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋，4℃保存,。

試劑六：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈,，再離心3min）待測,。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；8000g 4℃離心10min,，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）混勻待測,。

3. 血清等液體：直接測定,。

GSSG含量測定：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到412nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫30min。

3.取1 mL EP管,，加入100μ L上清液,，5 μ L試劑二，蓋緊后混勻,，得混合液,，置于37℃水浴30min；取21μ L混合液于96孔板,，然后依次加入20 μ L試劑四,、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六，迅速混勻后,，測定30 s和150 s光吸收A1和A2,，計算ΔA=A2-A1。

GSSG含量計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值(ΔA),。

2,、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4,、按細胞數(shù)量計算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷細胞數(shù)量

5,、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣

=36.23×(ΔA+0.0011)

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20μL,；V樣總：加入提取液體積,， 1mL；W：樣品質(zhì)量,，g,，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）,，y為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣×Cpr)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3,、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4,、按細胞數(shù)量計算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷細胞數(shù)量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷V樣

=72.46×(ΔA+0.0011)

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積,，20μL,；V樣總：加入提取液體積， 1mL,；W：樣品質(zhì)量，g,，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

注意事項：

1.        提取過程中去掉蛋白質(zhì),，所以提取液不能用于測定蛋白含量。

2.        臨用前配制的試劑配好后4℃保存,，2天內(nèi)使用完畢,。

3.        Z低檢出限為0.1μmol/L。

4.  反應(yīng)溫度嚴格來說,，為保證重復(fù)性,，應(yīng)在25℃下進行反應(yīng)。

5.   反應(yīng)時間需精確控制,，否則會影響反應(yīng)速率計算,，產(chǎn)生較大誤差。

6.   樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,，否則反應(yīng)速率太大,，沒法控制，所以稀釋倍數(shù)要盡量大些,。

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