谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶,，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH,，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值,。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用,，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。
測定原理：
GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH,，同時NADPH脫氫生成NADP+,；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長無吸收峰,；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率,，從而計算GR活性。
自備儀器和用品：
低溫離心機,、水浴鍋,、移液器、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板,、和蒸餾水
試劑組成和配置：
試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存,。
試劑二：粉劑×2支,，-20℃保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水,，混勻,。
試劑三：粉劑×2支，-20℃保存,。臨用前加入0.6mL蒸餾水,，混勻。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,，4℃離心15min,，取上清，置冰上待測,。
2. 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后8000g,，4℃，離心15min,，取上清置于冰上待測,。
3. 血清等液體：直接測定,。
操作步驟：
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min,。
3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板,，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二,，150μL試劑一,，20μL上清液，混勻,，于340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度,，記為A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2,。
注 意：
1.加完上清液后必須迅速混勻測定,，保證準(zhǔn)確測出初始反應(yīng)速度；
2.當(dāng)出現(xiàn)初始180s內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時,，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間,，選取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)吸光值變化值；
3.當(dāng)所測△A測定管的值在零點附近徘徊時,，可能原因：（1）樣本GR酶活性低,，建議濃縮樣本后再進(jìn)行測定；（2）樣本GR酶活性過高,，吸光值變化區(qū)間過小無法準(zhǔn)確測出,，建議樣本稀釋2~5倍后再進(jìn)行測定)
計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 536×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
= 536×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol,； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）,；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL =2×10-2 mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；V樣總：提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，3 min,。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 1072×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1072×△A測定管÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1072×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下,，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
=1072×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑,，0.5 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4
L,；106：1 mol=1×106μmol,； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，3 min,。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力,，勻漿液避免反復(fù)凍融,；
（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后,，置于冰上,，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完,。
（3）測定前須先用1～2個樣做預(yù)實驗,，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。
（4）細(xì)胞中GR活性測定時,，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GR的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,。
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