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谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng),，生成氧化型谷胱甘肽GSSG,，從而保護(hù)生物膜免受ROS的損害，維持細(xì)胞的正常功能,；而且具有保護(hù)肝臟,、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力,。

測定原理：

GSH-Px催化有機過氧化物氧化GSH,，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG,，再生GSH,，同時NADPH氧化生成NADP⁺；NADPH在340 nm有特征吸收峰,，而NADP⁺沒有,；通過測定340 nm光吸收減少速率來計算GSH-Px活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機,、水浴鍋,、可調(diào)節(jié)移液器、酶標(biāo)儀,、96孔板,、和蒸餾水,。

試劑組成和配置：

試劑一：液體120mL×1瓶，室溫保存,。

試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存。

試劑三：液體10μL×1支,，-20℃保存,。

試劑四：液體200μL×1瓶，4℃保存,。

粗酶液提?。?/span>

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g,，4℃離心10min，取上清置冰上待測,。

2.        細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定,。

GSH-Px測定操作：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到340 nm。

2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動物）水浴中預(yù)熱30min,。

3. 混合試劑配制：臨用前,，在試劑二中加入試劑一20 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三,，混勻,。（當(dāng)天用完）

4. 試劑四的稀釋：吸取21.5μL試劑四，加入5mL蒸餾水充分混勻,，臨用前配制,，配制好的試劑當(dāng)天使用。

5. 測定管：依次在96孔板中加入20μL上清液,、160μL預(yù)熱的混合試劑,、20μL稀釋后的試劑四,，迅速混勻后于340nm處測定第30 s和第210s的吸光值，分別記為A1和A2,。△A測定管= A1﹣A2,。

GSH-Px活性計算：

使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

GSH-Px活力單位定義：一定溫度中，每mg蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

=1072×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

GSH-Px活力單位定義：一定溫度中,，每g樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/g 鮮重)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：一定溫度中,，每10⁴個細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。

GSH-Px (nmol/min/10⁴ cell)= [△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位,。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷V樣÷T

=1072×△A

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm,；d：96孔板光徑，0.5 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，200μL=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol,； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）,；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL =2×10^-2 mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，3 min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,，且須在當(dāng)日測定酶活力,；

（2）混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上,，當(dāng)天使用完,；

（3）測定過程操作須迅速；

（4）細(xì)胞中GSH-Px活性測定時,，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間,，細(xì)胞中GSH-Px的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,。

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