焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP,，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中,，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化,，在光合作用碳代謝中起重要作用。
測定原理：
PFP催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖,，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛,，再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸,，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低,。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機,、研缽,、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板,。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存,。
試劑二：粉劑×1 瓶,，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。
試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存,。
試劑五：液體1mL×1瓶,，4℃避光保存。
試劑六：液體2mL×1瓶,，4℃避光保存,。
酶液提取：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min,，取上清置冰上待測,。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后4℃，10000g離心10min,，取上清置冰上待測,。
3. 液體：直接檢測。
測定操作：
1. 紫外分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。
2. 取微量石英比色皿/96孔板,，依次加入100μL試劑一,，20μL試劑二，20μL試劑三，10μL試劑四,，10μL
試劑五,，20μL試劑六，20μL粗酶液,，充分混勻,，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2，△A=A1-A2
計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T
=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量
（4）按照液體體積計算
酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.02mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T
= 643.08×ΔA÷細胞數(shù)量
（4）按照液體體積計算
酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
PFP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g
4
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)