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磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose-phosphate isomerase,，TPI）

試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化,，磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

測定原理：

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛,，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低。

自備實驗用品及儀器：

天平,、低溫離心機(jī),、研缽、震蕩儀,、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制：

提取液一：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。

提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體12mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存,。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

酶液提取

①總TPI酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴,，200W,，破碎3s，間歇7s,，總時間1min）,，然后4℃，8000g離心10min,，取上清測定,。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一）,，冰浴勻漿后于4℃,，200g離心5min，棄沉淀,，取上清在4℃,，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿TPI酶活性,，取沉淀加1mL提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W,，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定葉綠體中TPI酶活性。

建議測定總TPI酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI，則按照步驟②提取粗酶液,。

測定操作：

1.        分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2.        取微量石英比色皿/96孔板,，依次加入120μL試劑一，20μL試劑二,，20μL試劑三,，20μL試劑四，20μL

3.        粗酶液,，充分混勻,，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2，△A=A2-A1

計算公式：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g

b.       用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g

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