二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個關鍵酶，既控制著CO2的固定,，同時又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,，其活性的大小直接影響著光合速率。
測定原理：
在Rubisco的催化下,，1分子的核酮糖-1,，5-二磷酸（RuBP）與1分子的CO2結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）,，PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶I（NADH）氧化,。因此,，340nm吸光度的變化可計算還原型輔酶I氧化速率，還原型輔酶I氧化速率可反應Rubisco的活性,。
需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
提取液一：液體100mL×1瓶,，4℃保存。
提取液二：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑一：25mL×1瓶，4℃保存,；
試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃保存；臨用前加入10mL試劑一,，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,；
試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃保存；臨用前加入10mL試劑一,，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,；
試劑四：粉劑×1瓶,，-20℃保存；臨用前加入1 mL試劑一,，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,；
（注意：試劑二,、三、四溶解后,，按需分裝-20℃保存,。）
粗酶液制備：
①總Rubisco酶提取：建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W,，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min）,，然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定。
②胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一）,，冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min,，棄沉淀,，取上清在4℃，8000g離心10min,，取上清用于測定胞漿Rubisco酶活性，取沉淀加1mL提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定葉綠體中Rubisco酶活性。
建議測定總Rubisco酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco，則按照步驟②提取粗酶液,。
（注意：粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細胞破碎儀進行,。）
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。
2,、 樣本測定
（1） 工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1：1混合,，用多少配多少；
（2） 在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL樣本,、10uL試劑四和180uL工作液,，混勻，立即記錄340nm處20s時吸光值A1和5min20s時的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。
Rubisco活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
1,、按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。
Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr
此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,，建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,。
2、按樣本鮮重計算
單位的定義：25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH,。
Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
上述計算公式中各符合含義：
V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應時間，5min,；W：樣本質(zhì)量,，g。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
1,、按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH,。
Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr
此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,。
2,、按樣本鮮重計算
單位的定義：25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。
Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
上述計算公式中各符合含義：
V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，5 min；W：樣本質(zhì)量，g,。
4
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務