丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP,、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸,。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中，對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用,。
測定原理：
PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸,、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi,，乳酸脫氫酶進一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,，在340nm測定NADH減少速率，計算PPDK活性,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶,，4℃保存；
試劑一：液體25 mL×1瓶,， 4℃保存,；
試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存,；
試劑三 ：液體40μL×1支,，4℃保存,；體積較少，若沾在管壁上,，臨用前可低速離心后使用,。
樣本的前處理：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。
測定步驟和加樣表：
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2,、 樣本測定
（1）工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入10mL試劑一和5μL試劑三，充分混勻,，置于37℃水浴5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A1和37℃反應(yīng)5min后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。
PPDK活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。
PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g。
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