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甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase,，MCS）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

MCS廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

測定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔酶A,，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸,；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰,、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑三：液體1.5mL×1支，-20℃保存,；

試劑四：液體30mL×1瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶,，4℃保存,；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存,，臨用前加入1mL蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

②        將勻漿600g,，4℃離心5min。

③        棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。

④        上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑤        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3秒,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于線粒體CS測定。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1）在試劑五中加入1mL無水乙醇和22mL試劑四，混勻,，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑五和10μL試劑六，混勻,，記錄412nm處20秒時的初始吸光度A1和2分20秒時的吸光度A2,，計算ΔA=A2-A1。

MCS活性計算：

a.        使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬,。

b.       使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位,。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.711×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬,。

配方：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存,；（50mM Tris-HCl 7.4,，8.56g 蔗糖，88mg EDTA）

試劑二：液體20mL×1瓶,，4℃保存,；(10mM Tris-HCl 7.4，1％Trixton-100)

試劑三：液體1.5mL×1支,，4℃保存,；(100mM PMSF)

試劑四：液體×1瓶，4℃保存,；（稱0.135g Tris,，0.166g KCl，8.4mgEDTA,，溶于27.5mL雙蒸水,，用HCl調(diào)pH至7.5）

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,；（稱取2mg DTNB,，2mg 丙二酰CoA于30mL試劑瓶）

試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存；（稱取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管）

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