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α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒說明書

                                        微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物,、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一,，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A,。

測定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A,、 二氧化碳和 NADH,，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀,、水浴鍋、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑二：20mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1支,，-20℃保存,；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1瓶,，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、   稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2,、   將勻漿600g，4℃離心5min,。

3,、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。

4,、   上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5,、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W,，超聲3秒,，間隔10秒，重復(fù)30次）,，用于線粒體α-KGDH活性測定,。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、  樣本測定

（1）在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解,，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用,；

（2）在試劑六中加入1mL蒸餾水,，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五,，混勻,，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

α-KGDH活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

 α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

 α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。

α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。

α-KGDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

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