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琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase,，SDH）試劑盒說明書

                                          微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,。SDH是線粒體的一種標志酶，位于線粒體內膜上的一種膜結合酶,，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一,。此外，為多種原核細胞產能的呼吸鏈提供電子,。

測定原理：

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰,，通過600nm吸光度的變化,，測定2．6-DPIP的還原速度，代表SDH酶活性,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、水浴鍋、臺式離心機,、可調式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑二：20mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存,；

試劑四：粉劑×1瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支,，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、   稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、   將勻漿600g，4℃離心5min,。

3,、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。

4,、   上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的SDH（此步可選做）。

5,、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W,，超聲3秒,，間隔10秒，重復30次）,，用于線粒體SDH活性測定,。

測定步驟和加樣表：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至600nm,，蒸餾水調零。

2,、  樣本測定

（1）在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解,，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融,；

（2）在試劑五中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、10μL試劑五和180μL試劑四,，混勻，立即記錄

600nm處20s時的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。

SDH活性的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應時間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 SDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應時間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL；W：樣本質量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬,。

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